補料分批發(fā)酵是最重要的一種生產(chǎn)模式，是指在無(wú)菌條件下向發(fā)酵系統中補加一定物料，維持生物生長(cháng)和生產(chǎn)所需要的營(yíng)養或前體，介于分批發(fā)酵和連續發(fā)酵之間的一種發(fā)酵生產(chǎn)模式。
本文結合GMP最新要求和發(fā)酵的特點(diǎn)，歸納了四種常見(jiàn)的可定量的生物過(guò)程補料方式并簡(jiǎn)述了其優(yōu)缺點(diǎn)：四種方式分別是火焰插針?lè )绞�、可在線(xiàn)SIP的蠕動(dòng)泵補料方式，以及基于流量計和計量杯的補料方式。
有幾個(gè)涉及補料的發(fā)酵參數，如pH和泡沫控制，可通過(guò)PID自動(dòng)反饋調節。除此之外，更多補料如C源，N源，前體，誘導物，抑制劑等，它們在添加前需要對多個(gè)參數進(jìn)行相關(guān)性分析，往往不是一個(gè)，然后再根據經(jīng)驗規則制訂補加策略。由于目前還沒(méi)有一套可閉環(huán)控制的補料方案，所以需要不斷的根據參數變化來(lái)修改策略。 無(wú)論哪一種方式，都需要工藝人員掌握累積補料量和實(shí)時(shí)補料量，甚至對待它們要比測量的那些生理參數優(yōu)先級還要高，因此補料的定量控制能力成了對發(fā)酵設備的基本要求。同時(shí)，補料除了符合定量之外，還要考慮無(wú)菌因素和法規要求。
法規要求
新版GMP規定：發(fā)酵過(guò)程需補料操作時(shí)要求在無(wú)菌操作條件下進(jìn)行，應事先對補充的物料配制后補料前進(jìn)行在位滅菌或過(guò)濾滅菌，應對補料管路進(jìn)行滅菌保證無(wú)死角，應采用密閉或封閉系統進(jìn)行補料。以上規定對食品和原料藥生產(chǎn)涉及的發(fā)酵過(guò)程的補料進(jìn)行規范，大大降低了因補料導致的質(zhì)量風(fēng)險。
小規模生物過(guò)程補料
傳統蠕動(dòng)泵補料方式
①將配制好料液加到補料瓶a內，并用硅膠管d將補料瓶a和補料針組件e連接好，然后將補料針組件包上紗布和牛皮紙后，整體再放入滅菌鍋內滅菌；
②將滅菌后的硅膠管d安裝到蠕動(dòng)泵c內；
③對接種環(huán)境進(jìn)行消毒；
④在火焰保護下，將補料針刺穿補料組件上的硅膠塞，再旋緊補料針。
⑤打開(kāi)發(fā)酵自控系統上的補料程序，進(jìn)行自動(dòng)補料。
優(yōu)缺點(diǎn)：該工藝簡(jiǎn)單實(shí)用，雖然實(shí)際染菌率很低，卻因為是敞口操作，沒(méi)有合適的驗證方案，經(jīng)常不被GMP審核員認可，所以這種方法多見(jiàn)于試驗室。
具有SIP功能的補料方式
具體操作流程如下：
①將配制好料液加到補料瓶a，用硅膠管c將補料瓶a和補料隔膜閥e（含小排氣閥g、卡箍連接件i、j）連接好，關(guān)閉隔膜閥e后，整體放入滅菌鍋內滅菌；
②將滅菌后的硅膠管c安裝到蠕動(dòng)泵d內，并用卡箍連接件i、j將補料隔膜閥門(mén)e、小排氣閥g與相應管路連接好；
③打進(jìn)蒸汽閥h，打開(kāi)小排氣閥g，稍微打開(kāi)補料隔膜閥f，對補料管路進(jìn)行滅菌；
④滅菌完畢后關(guān)閉進(jìn)蒸汽閥h和小排氣閥g，打開(kāi)補料隔膜閥e；
⑤打開(kāi)計算機控制系統上的補料程序，進(jìn)行自動(dòng)補料。
優(yōu)缺點(diǎn)：該方法最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以對整個(gè)補料管路進(jìn)行在線(xiàn)SIP，徹底消除滅菌隱患，滿(mǎn)足GMP法規的要求，但是只能應用于試驗罐或小規模發(fā)酵補料。
注意點(diǎn)：呼吸過(guò)濾器的完整性往往被用戶(hù)忽視，導致染菌而不自知。
大規模生物過(guò)程補料
基于流量計的補料
流量計一般選用質(zhì)量流量計、電磁流量計、渦街流量計等。其中質(zhì)量流量計適用于電導率低的介質(zhì)，測量精度可達到±0.25%；電磁流量計適用于電導率高的介質(zhì)，測量精度達到±0.5%；渦街流量計適用于電導率低的介質(zhì)，測量精度達到±0.75%，可根據實(shí)際情況要求選擇相應的流量計。
流量計式補料系統工藝流程見(jiàn)上圖，流量計與氣動(dòng)隔膜閥組成一個(gè)補料控制回路，流量計檢測累計補料量，氣動(dòng)隔膜閥控制流加�？刂撇呗钥梢苑譃閮煞N：一種是與pH、DO、濁度等分析儀表進(jìn)行閉環(huán)控制，例如補堿、氨水、消泡劑等；另一種是按時(shí)間和數量進(jìn)行的流加控制，例如補硫胺、糖液等。
補料控制一般采用PID控制，每隔一個(gè)掃描周期采樣一次，與上次的數值進(jìn)行對比，通過(guò)PID算法將補料量轉換為開(kāi)閥時(shí)間。
優(yōu)缺點(diǎn)：結構簡(jiǎn)單，功能強大，與計算機配合可實(shí)現自動(dòng)補料工藝。缺點(diǎn)是對不同的補料通用性稍差，易受流量計前后壓力波動(dòng)的影響等，但從長(cháng)遠看這是一種能夠替代計量杯補料的系統。
基于計量杯的補料方式
計量杯式補料系統在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中應用較廣，其原理是把欲補充的營(yíng)養物質(zhì)按計量罐的容積，根據補料速率，換算成相應的時(shí)間，然后等間隔地流加進(jìn)發(fā)酵罐。
計量杯式補料系統工藝流程見(jiàn)上圖，主要由進(jìn)料隔膜閥、計量罐、高/低液位電極、出料隔膜閥等組成。具體操作流程如下：
①在發(fā)酵實(shí)罐滅菌時(shí)，對計量杯系統進(jìn)行滅菌，或者在補料前對料液分配系統進(jìn)行滅菌；
②滅菌完成后，關(guān)閉小排氣閥h和l，關(guān)閉進(jìn)料氣動(dòng)隔膜閥b、出料氣動(dòng)隔膜閥k，打開(kāi)進(jìn)料手動(dòng)隔膜閥j和壓力平衡閥；
③打開(kāi)計算機控制系統上的補料程序，開(kāi)始根據設定自動(dòng)補料。
該補料方式的優(yōu)點(diǎn)是計量準確，直觀(guān)，通用性好。
缺點(diǎn)是：使用高低液位電極原理的計量杯式補料系統僅適用于電導率高的液體，對于補油，需要將這種電極更換成光學(xué)傳感器；另外，這種方式涉及了大量的閥門(mén)管道，因此導致操作復雜，容易形成滅菌死角，且維護不方便，未來(lái)很可能被其他補料方式取代。
